Cytologické vyšetření mízních uzlin
Minimální invazivita, jednoduchost provedení a potenciál odhalení definitivní diagnózy řadí cytologické vyšetření mízních uzlin k základním diagnostickým krokům doplňujícím klinicko-patologický obraz u řady onemocnění provázených lokální nebo generalizovanou lymfadenopatií.
Tenkojehelná biopsie s morfologickým vyšetřením mízních uzlin (MU) poskytuje prostor pro základní orientaci na úrovni 4 cytologických diagnóz:
reaktivní MU, lymfadenitidy, lymfomu a metastáze (v rámci onkologického stagingu, s možností monitoringu relapsu nebo efektivnosti chemoterapie/radioterapie).
Hlavní indikací pro cytologické vyšetření mízní uzliny je tedy její jakékoliv zvětšení, příp. změna konzistence. Při konfirmaci diagnózy primární maligní neoplazie je doporučen odběr z příslušné regionální MU bez ohledu na klinický nález (velikost, konzistence).
Specifika odběru a zpracování vzorků z MU
V případě lymfadenopatie postihující multipní mízní uzliny, příp. u generalizované lymfadenopatie, je jednoznačně preferován odběr z různých anatomických lokalizací. Je chybou, pokud u pacienta prezentovaného s generalizovanou periferní lymfadenopatií, jsou vzorky odebrány pouze z jedné MU. Cytologický obraz může být totiž v jednotlivých MU zcela odlišný (Cowell et al. 2003).
U periferních lymfadenopatií je doporučován odběr alespoň ze dvou změněných mízních uzlin, přičemž z každé by měly být odebrány alespoň 4 vzorky. Z MU v dutině břišní, příp. hrudní je optimální odebrat alespoň 5 vzorků na jednu změněnou MU (Sapierzynski et al. 2012). Mandibulární MU vzhledem k jejich spádové oblasti dutiny ústní mohou být často pouze reaktivní, příp. zánětlivě změněné, primární nádorový proces nemusí být snadno odhalen. Odběr z mandibulárních MU by měl být proveden pouze, jsou-li tyto uzliny jedinými, které jsou klinicky abnormální, příp. drénují oblast, v níž byl identifikován primární tumor. Nezměněné mízní uzliny se odebírají relativně obtížně, vzorky často obsahují pouze perinodální tuk s malou populací lymfoidních buněk, a to především u popliteálních MU (Cowell et al. 2003).
Narozdíl od jiných tkání, jsou vzorky z MU konstantně vysoce celulární (zejména u výrazné hyperplazie/lymfomu), řídké odběry jsou proto indikací neadekvátní techniky odběru. U zánětlivě změněných MU z důvodů zvýšené cévní permeability mohou být vzorky pouze středně celulární. Extrémně zvětšené mízní uzliny mohou obsahovat velká ložiska centrální nekrózy a hemoragií, jehla by tak měla být vedena víc tangenciálně, nikoliv centrálně (Williams et al. 2005).
K získání reprezentativní populace pro danou lézi je nutné odebírat vzorky z různých míst (zejména předpokládá-li se přítomnost metastatických buněk) z každé odebírané MU. Pod vlivem antigenní stimulace dochází v germinativních folikulech kortexu MU k intenzivní buněčné proliferaci a diferenciaci B-lymfocytů v plazmatické buňky. Při aspiraci germinativního centra MU je tedy vysoká pravděpodobnost přítomnosti blasticky transformované populace, která snadno imituje neoplastickou populaci. Odběr z různých směrů v průběhu jednoho vpichu, resp. opakované odběry z různých místa anatomicky odlišných MU toto riziko zkreslení minimalizuje.
Vzhledem k vyšší fragilitě lymfocytů ve srovnání s jinými populacemi je preferovánaneaspirační technika tenkojehelné biopsie(fine needle biopsy, FNB). Příliš rázná aspirace s větším pod tlakem vede k destrukci lymfoidních buněk a výrazné hemokontaminaci znehodnocující vzorek. Při použití jehly většího průměru než 22G (0,7 mm) hrozí aspirace malých kousků tkáně bez možnosti posouzení volné buněčné populace a rovněž výraznější hemokontaminace (MacNeill 2011).
U výrazné hyperplazie/lymfomu se častěji stává, že vzorek je až extrémně celulární. U zpracování je proto nutné dbát na pečlivé rozetření buněk do monolayeru. Roztěr musí být proveden bez použití jakéhokoliv tlaku. Poškozené buňky se mohou jevit jako monomorfní populace středně velkých lymfocytů připomínající maligní lymocyty. Buňky v hustých oblastech navíc špatně absorbují barvivo a mohou imitovat nezralé buňky s prominujícími jadérky, případná ztráta jaderného detailu znemožní rovněž posouzení charakteru chromatinu (Cowell et al. 2003).
Kromě klasického roztěru materiálu jemným tahem mezi dvěma podložními skly lze ke zpracování použít také techniku nátěru, kdy se přenesená kapka rozetře podobně jako kapka krve. Tato technika vede obvykle k dostatečně tenkým preparátům s menší pravděpodobností mechanické destrukce buněk, a to především u fragilnějších neoplastických populací.
Délku barvení doporučenou výrobcem komerčních rychlobarvících kitů (Hemacolor, Diff Quick) je nutné přizpůsobit celularitě (tloušťce) preparátu. Cílem je adekvátní obarvení s optimálním morfologickým detailem v oblastech buněčného monolayeru, tedy nikoliv hrubým, ale ani extrémně nízce celulárním.
Nejčastějším důvodem neadekvátního obarvení preparátu je příliš tlustý preparát s vysokou celularitou nebo neadekvátní doba barvení, příp. exspirované barvící roztoky. Buňky jsou vybledlé s nedostatečně zřetelnou demarkací jádra a cytoplazmy a se ztrátou jaderného detailu. Špatně obarvené preparáty lze dobarvit, optimálně před použitím imerze, ale nikoliv odbarvit. Jako kontrolní populace pro posouzení kvality barevných poměrů mohou posloužit neutrofily.
Morfologické hodnocení aspirátů MU
Systematickým přístupem je nejdřív zhodnocena populace lymfocytů, následně ostatní nelymfoidní buněčné populace. Hlavními morfologickými kritériemi při posuzování lymfoidní populace jsou:
velikost lymfocytů, jejich četnost (vzájemný poměr) a morfologie. Adekvátní posouzení velikosti je možné pouze v tenké vrstvě nátěru s přítomností intaktních buněk. Optimálním měřítkem pro diferenciaci lymfocytů (ly) na malé, intermediární a velké lymfocyty je erytrocyt (ery).
- malé ly – jádro 1-1,5x velikosti ery,
- střední ly – jádro 1,5-2x větší než ery,
- velké ly – jádro větší než 2x velikost ery.
Dalšími kritérii jsou tvar jádra (přítomnost zářezů, vchlípení), charakter chromatinu (jemný, hrubý), počet, velikost a pozice jadérek, množství a bazofilie cytoplazmy. Jakoblast je identifikován intermediární až velký lymfocyt, s jemným chromatinem, prominujícím jadérkem (jadérky) a větším množstvím intenzivně bazofilní cytoplazmy, ve které se mohou nacházet drobné vakuoly. Buňky charakteru blastů však mohou mít i velikost malých lymfocytů. Blasty jsou v nízké koncentraci fyziologickou populací MU, jejich zastoupení se zvyšuje jak pod vlivem imunostimulace, tak u lymfomů. Nález blastů tvořících víc než 50 % z celkové buněčné populace je obecně akceptovaným kritériem pro cytologickou diagnózu lymfomu (MacNeill 2011).
Odhad mitotické aktivity se odvíjí od hodnocení mitotického indexu (MI) – průměrného počtu mitóz na 5 zorných polí při 400x zvětšení. Pro high-grade lymfomy je charakteristický střední až vysoký MI, s výskytem pravidelných i atypických mitóz. (Valli et al. 2011). Nízký MI odpovídá 0-1 mitóze/5 ZP, střední 2-4/5 ZP a vysoký víc než 5 mitózám/5 ZP. Distribuce mitotických figur je však v aspirátách často nerovnoměrná (Fournel-Fleury et al. 2002).
Základní cytologický obraz MU
Mízní uzlina je lymfopoetický orgán obsahující heterogenní populaci buněk imunitního systému, včetně lymfoblastů, plazmatických buněk a antigen-prezentujících buněk.
Normální mízní uzlina obsahuje 75 – 90 % malých lymfocytů, 10 – 15 % intermediárních lymfocytů a do 5 % velkých blastů. Ojediněle se mohou vyskytnout plazmatické buňky, histiocyty, makrofágy a neutrofily (častěji při hemokontaminaci). Mastocyty jsou pozorovány pouze u necelé čtvrtiny klinicky zdravých psů, s průměrným počtem 6 mastocytů na vzorek (Bookbinder et al. 1992).
Identifikace přítomnosti lymfatické tkáně při aspiraci tumoru neznámé etiologie je kromě výrazně dominujícího nálezu lymfocytární populace dána přítomností cytoplazmatických fragmentů – lymfoglandulárních (LG) tělísek jejichž počet, příp. velikost se při intenzivní buněčné replikaci zvyšuje. Jejích nález však nemá bližší diagnostickou výpovědní hodnotu.
Nejčastější diagnózou u lymfadenomegalie malých zvířat je lymfom a reaktivní hyperplazie, podstatně méně často pak metastáze a lymfadenitida (Sapierzyńsky a Micuń 2009, Amores-Fuster et al. 2015). U psů byl s 38% incidencí z 928 diagnostických vzorků nejčastěji zjištěn lymfom, u koček s 37% výskytem ze 171 diagnostických vzorků reaktivní hyperplazie (Amores-Fuster et al. 2015)
Lymfom
Cytologické vyšetření mízních uzlin je ve vztahu k lymfomu akceptováno jako spolehlivá screeningová metoda (Mills 1989, Caniatti et al. 1996). Srovnatelných výsledků s jinými diagnostickými metodami lze docílit kombinací cytologie s imunofenotypizací (Teske a van Heerde 1996, Sözmen et al. 2005). Potvrzení lymfomu v MU je vzhledem k fyziologické role lymfatické tkáně ve srovnání s cytologickou diagnostikou jiných neoplastických procesů mnohem obtížnější. Přítomnost některých maligních kritérií (vícečetná jadérka, makronukleoly, vysoký mitotický index) kromě lymfomu může být pozorována rovněž u chronických systémových zánětů (ehrlichióza, babezióza, leishmanióza, pyodermie, imunitně zprostředkovaná onemocnění), tj. reaktivní lymfocytární populace nese identické morfologické atypie jako neoplastický klon. U některých subtypů lymfomů (malobuněčných low-grade lmyfomů) se neoplastická populace morfologicky nemusí vůči normální lymfocytární populaci nijak výrazně vymezovat.
Revidovaná Kielská klasifikace lymfomů (1997) kombinuje cytomorfologická kritéria s imunofenotypem. Klasické ponětí morfologické charakteristiky lymfomu vychází z předpokladu uniformity monoklonální populace. Kritérium jednotného tvaru však není možné uplatnit u všech subtypů. U pleomorfních T-podtypů tvořících 24 % všech T-lymfomů jsou přítomné lymfocyty různé velikosti (Fournel-Fleury et al. 2002).
Z hlediska hodnocení aktivity rozlišuje cytologický přístup 2 formy lymfomu: low-grade a high-grade, přičemž u high-grade forem je MI střední až vysoký, u low-grade forem nízký. Většina lymfomů psů je zastoupena high-grade formou, 80 – 86 % (Sözmen et al. 2005, Sapierzyński et al. 2010).
Cytologicky lze nejsnadněji identifikovat jako morfologicky atypické buňky lymfocyty charakteru blastů u high-grade foremlymfomů. Jejich dominantní zastoupení v MU splňuje základní kritérium pro diagnózu lymfom (počet blastů přesahující 50 %). Se stoupajícím % blastů stoupá rovněž jistota diagnózy. Je-li kritérium nastaveno na 80 %, je cytologická diagnóza správná až u 90 % pacientů (Sapierzynski et al. 2012). Cytologicky je však nemožné rozpoznat kategorie lymfomů ze skupiny malobuněčných lymfomů a lymfomy z intermediárních lymfocytů, jejichž lymfocytární populace mají morfologicky charakter zralých buněk – low-grade formy. U těchto podtypů nelze neoplastický původ lymfocytů cytologicky prokázat ani při jejich výrazně dominantním zastoupení. Zatímco u psů jsou častěji zastoupené lymfoblastické lymfomy, u koček převažují lymfomy z malých a intermediárních lymfocytů (Hayes 2006).
Samotná morfologie lymfocytů může u některých subtypů naznačovat jejich imunofenotyp. B-lymfomy mají často plazmocytoidní charakter, který je dán excentricky uloženým jádrem s perinukleárním projasněním (odpovídajícím aktivní syntéze proteinů v Golgiho aparátu) a výrazně bazofilní cytoplazmou. Cytologická kritéria pro T-lymfomy představují nepravidelné okraje jádra a abundantní světlá cytoplazma (Ponce et al. 2003, Fournel-Fleury et al. 2002, Fournel-Fleury et al. 2012). Výjimkou je plazmocytoidní high-grade subtyp T-lymfomu tvořící méně než 4 % všech lymfomů psů s morfologií charakteristickou pro plazmacytoidní populaci, který je rozpoznán až na základě imunofenotypizace. U těchto subtypů T-lymfomů prezentujících se B-morfologií jsou navíc na pozadí často pozorovány plazmatické buňky, imitující obraz reaktivní MU (Fournel-Fleury et al. 2002, Teske et al. 1994). Plazmocytoidní high-grade T-lymfomy jsou vysoce agresivní formou lymfomu, u níž téměř v 80 % případů je současně potvrzena infiltrace kostní dřeně (Ponce et al. 2003).
Cytologické vyšetření MU je vhodnou metodou také pro kontrolu stavu remise, příp. odhalení časného relapsu (Williams et al. 2005).
Metastatická neoplazie
Jako metastatická populace je identifikován nález buněk, které nejsou tkáni MU vlastní (např. skvamózní epiteliální buňky) nebo nález vysokého % jinak sporadicky se vyskytujících buněk (např. mastocyty, melanocyty). Nosním kritériem pro konfirmaci mirkometastáz je přítomnost atypických clusterů, příp. exprese maligních kriterií. Vzhledem k vysoké celularitě aspirátů může být identifikace několika individuálních metastatických buněk obtížná. Pomocným vodítkem je možnost současného cytologického vyšetření primárního tumoru. Přítomnost jader větších než 4násobek erytrocytu svědčí vysoce pravděpodobně pro metastatickou lézi. Metastatické buňky se mohou nacházet v kterémkoliv místě preparátu, pro vyloučení mikrometastáz je tedy nutné pečlivé posouzení všech odebraných vzorků (MacNeill 2011).
Regionální mízní uzliny jsou u většiny nádorů prvním místem záchytu metastatické populace. Vzhledem k nízké senzitivitě palpačního vyšetření MU ve vztahu k posouzení metastatického rozsevu je cytologické vyšetření spádové MU indikováno u všech solidních maligních tumorů. Palpačně normální mízní uzliny můžou obsahovat cytologicky detekovatelné metastáze a naopak klinicky abnormální MU mohou být změněny pouze z důvodu probíhajícího zánětu nebo reaktivní hyperplazie (Lagenbach et al. 2001).
Negativní cytologický nález přítomnost metastatického onemocnění nevylučuje.
Velikost solidního tumoru se nezdá být signifikantně asociovaná s metastatickým potenciálem. Karcinomy (7/16) však ve srovnání se sarkomy (2/18) metastazují do regionálních MU signifikantně častěji. Důvodem je hematogenní rozsev u sarkomů, zatímco pro karcinomy je charakteristická diseminace lymfogenní cestou. Tenkojehelná biopsie regionální MU u 44 solidních tumorů psů a koček odhalila 100 % senzitivitu a 96 % specifičnost pro detekci metastatické populace. Jediný pacient, u něhož byla cytologicky potvrzena metastáze bez histologické konfirmace, byl pacient s mastocytomem (Lagenbach et al. 2001).
U maxilofaciálních neoplazií psů a koček zahrnujících nejčastěji skvamocelulární karcinom, sarkom a melanom, cytologické vyšetření mandibulárních MU pozitivně koreluje s výsledky histopatologického vyšetření. Mandibulární MU však zdaleka nejsou jedinou metastaticky postiženou regionální MU v této lokalizaci. Pouze polovina z 31 případů s metastatickou diseminací těchto neoplazií zahrnovala i pozitivní cytologický nález v mandibulární MU (Herrings et al. 2002)
Pro identifikaci metastatického mastocytomu na základě cytologického vyšetření MU nejsou přijata jednoznačná kritéria. U klinicky zdravých psů se počet mastocytů v aspirátu MU může pohybovat v relativně širokém rozmezí 1-16 mastocytů/vzorek (Bookbinder et al. 1992). Přesnější než absolutní počet mastocytů v aspirátu MU se jeví přítomnost mastocytů ve shlucích. Jako cytologický průkaz metastatické populace mastocytů v MU bylo publikováno několik formulací:
- mastocyty tvořící víc než 3 % z celkové populace nebo víc než 20 mastocytů prezentujících alespoň tři kritéria malignity – střední až výraznou anizocytózu, střední až výraznou anizokaryózu, zvýšený N:C poměr, variabilní tvar/počet jader nebo jadérek, slabou nebo variabilní granularitu, přítomnost shluků a/nebo eozinofilů (Warland et al. 2012),
- repopulace lymfatické tkáně MU mastocyty a/nebo přítomnost slabě diferencovaných mastocytů vykazujících pleomorfizmus, anizocytózu, anizokaryózu, sníženou/variabilní granularitu a/nebo víc než 5 shluků mastocytů sestávajících z víc než 3 mastocytů (Krick et al. 2009).
Za pouze pravděpodobnou metastázi lze označit nález víc než 3 shluků mastocytů složených z 2-3 buněk a/nebo 2-5 shluků mastocytů složených z víc než 3 buněk. Jako možnou metastázi lze pojmenovat nález 2-3 shluků mastocytů složených z 2-3 buněk. Metastatická populace v regionální MU byla v souboru 152 psů s kožním mastocytomem cytologicky potvrzena u 36 % zvířat. Tito pacienti měli ve srovnání s ostatními jedinci signifikantně kratší medián přežití, 0,8 roku vs. 6,2 roku (Krick et al. 2009).
Reaktivní/Hyperplastická MU
Reaktivně změněná MU má cytologicky víc heterogenní charakter vyplývající z různé velikosti buněk, struktury chromatinu, množství a barvitelnosti cytoplazmy. Malé lymfocyty zůstávají dominující populací, zmnožení je patrné na intermediárních lymfocytech a velkých lymfoblastech. Častěji jsou také pozorovány plazmatické buňky (víc než 2 %), příp. histiocyty a makrofágy. Nezřídka je mírně četnější také populace neutrofilů (do 5 % všech jaderných buněk). Sporadicky mohou být pozorovány rovněž eozinofily (do 3 % všech jaderných buněk), příp. individuální mastocyty (Cowell et al. 2003, Krick et al. 2009, MacNeill 2011).
Normální cytologický obraz u klinicky zvětšené MU hyperplazii nevylučuje.
Lymfadenititida
Podle zmnožené populace neutrofilů (nad 5 %) nebo eozinofilů (nad 3 %) lze lymfadenitidu klasifikovat jako supurativní nebo eozinofilní. Při současném zmnožení neutrofilů a makrofágů/histiocytů (nad 2 %) jako pyogranulomatózní. Současně s lymfadenitidou je často také pozorována hyperplazie MU (Cowell et al. 2003).
Supurativní lymfadenitidy mohou sekundárně provázat také metastatickou diseminaci, paralelně probíhající purulentní zánět s identifikací metastatických neoplastických buněk je nejčastěji pozorován u skvamocelulárního karcinomu a melanomu (MacNeill 2011).
Shrnutí nejčastějších příčin nediagnostických vzorků MU
Důvodem získání jiné než lymfoidní populace je kromě aspirace perinodálního tukunechtěný odběr slinné žlázy. Hlavní příčinou nediagnostických vzorků z důvodu nízké celularity představuje hemokontaminace. Častější střídání různých směrů při jednom odběru stejně jako aspirační technika je spojeno s vyšší pravděpodobností ruptury kapilár a kontaminací vzorku krví. Příčinou nízce celulárních vzorků je také příliš pomalá nebo mělká pasáž jehlou. Nevhodné zpracování pod tlakem je spojeno s morfologickým poškozením lymfocytů.
Žádoucím je tedy získat reprezentativní, vysoce celulární plochy s přítomností intaktní populace rozetřené v monolayeru s morfologickým detailem umožňujícím posouzení charakteru jaderného chromatinu včetně přítomnosti a morfologie nukleolů.
Autor:
MVDr. Kristína Řeháková, Ph.D.
VetHelp
Grohova 3
602 00 Brno
Česká Republika
e-mail: vethelp@vethelp.cz