Odběr a vyšetření kostní dřeně

Odběr a vyšetření aspirátu kostní dřeně

Úvod

S razantním pokrokem veterinární medicíny a vzrůstající ochotou majitelů investovat do diagnostiky a terapie svých domácích zvířat (považovaných ne neprávem za členy rodiny) se stalo nevyhnutelností používání diagnostickým metod a vyšetření, které ještě před několika lety byly považovány za nereálné a vyvolávaly v lepším případě ironické úsměvy či poklepávání na čele. Mezi nejmarkantnější případy patří v oblasti zobrazovacích metod magnetická rezonance (MRI) nebo artroskopické a laparoskopické diagnosticko-terapeutické zákroky. Na poli interní hematologie je takovýmto „zjevem“ bezesporu cytologické vyšetření kostní dřeně. I když je toto vyšetření známé a doporučované již minimálně desetiletí, není v našich českých (a slovenských) reáliích dle autorových zkušeností téměř vůbec prováděné. Jedním z logických a pochopitelných důvodů je poměrně vysoký nárok na cytologické znalosti a zkušenosti posuzovatele aspirátu kostní dřeně a s tím spojenou (a ještě možná náročnější) interpretaci. Pro interpretaci a klinické uplatnění nálezů vyšetření kostní dřeně je esenciální znalost klinické medicíny, což je jeden z mnoha důvodů, proč je naprosto nevhodné využívat služeb humánního specialisty bez teoretických a praktických zkušeností z veterinární hematologie.

Naopak neopodstatněná je obava z odběru vzorku a přehánění možných rizik a kontraindikací aspirace kostní dřeně. Autorovy vlastní zkušenosti i zkušenosti zahraničních renomovaných pracovišť jsou jednoznačné – odběr vzorku je technicky velmi nenáročný a rizika a nepříznivé efekty a následky nejsou téměř žádné.

Histologické vyšetření kostní dřeně („core biopsy“) je ve srovnání s cytologickým vyšetřením technicky i časově náročnější, dražší a neumožňuje takové detailní posouzení buněčné morfologie. Navíc je nutné na něj většinu pacientů přinejmenším sedovat.
Cílem tohoto příspěvku je seznámit čtenáře s indikacemi a kontraindikacemi odběru kostní dřeně, s technikou odběru vzorků a v neposlední řadě pokusit se rozptýlit případné obavy z odběru kostní dřeně.

Klinické indikace

1. Neregenerativní nebo špatně regenerativní anemie (nevysvětlitelná jinými vyšetřeními),
2. trombocytopenie, i závažná, která je spojená s klinickými projevy – krvácivostí (zejména ty závažné jsou indikací k vyšetření kostní dřeně!),
3. perzistentní neutropenie,
4. pancytopenie,
5. „pravá“ polycytemie – bez známek dehydratace či hemokoncentrace, u jiných než chrtovitých plemen,
6. nevysvětlitelná výrazná trombocytóza,
7. nevysvětlitelná perzistující leukocytóza, zejména lymfocytóza a neutrofilie,
8. nález morfologicky abnormálních buněk v krevním nátěru (například nález většího množství jaderných erytroidních buněk bez současně se vyskytující anemie),
9. součást diagnostiky syndromu „horečky neznámého původu“,
10. diagnostika, případně monitoring terapie leishmaniózy,
11. nevysvětlitelná hyperkalcemie a/nebo hyperglobulinemie (podezření na multipní myelom nebo lymfom/leukémii),
12. a součást „stagingu“ nádorů, zejména lymfomu a mastocytomu.

Kontraindikace

Nespolupracující/agresivní pes nebo kočka bez možnosti sedace, jinak žádné (!).

Technika odběru

1. volba místa odběru: v literatuře je popsáno mnoho míst použitelných k biopsii. Autor využívá jako první volby proximální hlavici humeru, v místě tuberculum majus (obrázek 1) a jako alternativu dorsální okraj hřebenu kosti kyčelní (obrázek 2 a 3). Důvodem této preference je fakt, že jsou obě tyto lokality snadno identifikovatelné na těle psů (i pro internisty) a velmi dobře dostupné a to i u obézních pacientů.
2. příprava pacienta: po standartní přípravě sterilního pole doporučuji lokální anestézii – aplikace 0,5 – 1 ml lokálního anestetika (autor používá 2% lidokain) na periost v místě průniku odběrové jehly do kosti.
3. výběr bioptické jehly: podmínkou je dostatečná tloušťka jehly (16 – 18 G) a vyjímatelný a znovu zasunovatelný mandrén (stylet) (obrázek 4).
4. technika odběru: jehla se vpichuje do kostní dřeně vždy s mandrénem, v místě vpichu je možno udělat kožní incizi (není podmínkou). Jehlu je nutno držet tak aby byla opřena opačným koncem (konusem s hlavicí mandrénu) o dlaň a mezi prsty je sevřena jehla. Po iniciálním vpichu je jehla zaváděna krouživými pohyby střádavě ve směru a proti směru hodinových ručiček až do momentu, kdy se zdá být v kostní dřeni (pod kompaktou kosti). Jednoduchým testem je „cvrnknutí“ prstem do konusu jehly a pokud „vibruje“ tak je pevně ukotvená v kosti a šance na úspěšný odběr vzorku je vysoká. Po vytažení mandrénu asistentem je na konus jehly nasazena stříkačka (10 nebo 20 ml) a vyvinut pístem co největší podtlak. Při úspěšném odběru se objeví v konusu jehly a ve stříkačce malý objem krvavé tekutiny, pokud tomu tak je, je povolen podtlak a píst pomalu vrácen do původní pozice. Jehla i se stříkačkou je vytažena z kosti a vzorek je pomocí tlaku vzduchu stříkačky přenesen na připravená podložní sklíčka postavená v úhlu cca 60° k podložce. Pokud se při vytváření podtlaku neobjeví v konusu vzorek, je nutno vrátit mandrén zpět do jehly a pokračuje se v zavádění jak je výše popsáno. Po vytažení jehly je nutno na místo vpichu přiložit gázu napuštěnou desinfekcí a komprimovat manuálně (silným tlakem) alespoň 5 minut.

Vytvoření preparátu metodou roztěru

Vzorek kostní dřeně se nechá stéct po sklíčku a ihned (do 10 sekund) se roztírá druhým sklíčkem čímž se vytvoří dva preparáty (obrázek 5). Kostní dřeň se za několik sekund sráží, proto je nutné pracovat velmi rychle. Doporučuji provádět roztěry ve dvou osobách, aby bylo vytvořeno co nejvíce kvalitních vzorků. Proti srážení je možno stříkačku „protáhnout“ pár kapkami 5% roztoku EDTA. Heparin je pro tento účel nevhodný, protože mění morfologii buněk.

Fixace a obarvení vzorků

Prvním krokem je důkladné zaschnutí sklíček. Pokud jsou sklíčka se vzorky dobře zaschnutá a skladována v suchu lze je skladovat i několik dnů bez ztráty kvality preparátu. Barvit je možno různými typy barvení. Velmi dobrý detail cytoplazmy a hlavně jader poskytuje zejména barvení May-Grünwald Giemsa. Detailní obarvení vzorků kostní dřeně vyžaduje často delší lázeň v barvících roztocích ve srovnání s méně buněčnými vzorky jako např. krevní nátěr. Pokud jsou vzorky odesílány na posouzení, je vhodné poslat vždy více, zejména neobarvených vzorků.

Nejčastější chyby a obtíže

1. Nátěr neobsahuje „zrnka“ ani buňky kostní dřeně, pouze krev.
   1. Vzorek nebyl odebrán z kostní dřeně, ale z kompakty, nebo cévy v podkoží.
   2. Při aspiraci stříkačkou nebyl vyvinut dostatečný podtlak a došlo jen k nasátí krve
   3. Na aspiraci byla použita stříkačka menší než 10 ml
   4. Jedná se o tzv. prázdnou kostní dřeň, tedy v dané lokalitě je již funkční tkáň kostní dřeně plně nahrazena tukovou tkání. Dochází k tomu zejména u starších pacientů. Odběr kostní dřeně je nutno opakovat z jiného místa, nejlépe z dorsálního okraje kosti kyčelní, kde zůstává aktivní kostní dřeň do vysokého věku.
2. Po počátečním silném odporu při zavádění jehly – při odběru z proximální hlavice humeru – došlo náhle k uvolnění odporu, při aspiraci je natažena do stříkačky průhledná, žlutavá nebo krvavá, silně viskózní tekutina
   1. došlo k punkci ramenního kloubu. Zachovat klid, jehlu krouživým pohybem vytáhnout. Na pacientovi se tato drobná nehoda většinou klinicky neprojeví.
3. Buňky jsou destruované, ve formě tzv. volných jader nebo vláken chromatinu.
   1. Nešetrným zpracováním (přílišné tlačení na sklíčka při roztěru) došlo k destrukci buněk
   2. Pacient trpí leukemií/lymfomem metastazujícím do kostní dřeně a všechny buňky jsou lymfoblasty, které jsou velmi fragilní a může dojít k jejich destrukci i při relativně šetrném zpracování vzorku.
   3. Pacient trpí onemocněním způsobující nekrózu kostní dřeně.
   4. Pacient je mrtvý (postmortální nekróza nastupuje velmi rychle a tudíž i posuzování a interpretace vzorků kostní dřeně odebraných při pitvě je velmi obtížné).
4. Jaderné buňky jsou soustředěné do shluků (neleží v jedné rovině) často se ve shlucích nachází „sít“ amorfní hmoty a/nebo s agregáty trombocytů.
   1. Došlo ke koagulaci vzorku. Jedná se o velmi častý problém zejména u začátečníků. Proto doporučuji zejm. ze začátku do jehly a stříkačky natáhnout kapku roztoku EDTA.
5. Buňky jsou místy velmi málo obarvené, zejména uprostřed preparátu, nebo jsou místy příliš eosinofilní nebo příliš basofilní. Na okraji vzorku jsou buňky často přebarvené.
   1. Nerovnoměrné obarvení je poměrně časté u nerovnoměrně silné vrstvy preparátu. Doporučuji neprodlužovat dobu barvení, ale během barvení třepat nebo „štěrchat“ s nádobkou se vzorky.
6. Buňky jsou málo obarvené v téměř celém preparátu.
   1. Krátká doba barvení. Často je nutno až zdvojnásobit dobu barvení oproti krevnímu nátěru
   2. Staré nebo vyčerpané barvení. Výměna (nikoliv dolévání!) barev by měla být prováděna min. 2x měsíčně i při minimálním počtu barvených preparátů. V laboratořích kde se vyšetřuje více jak 20 vzorků denně by se měly barvící roztoky vyměňovat za nové denně.

Komplikace a vedlejší efekty aspirace kostní dřeně

Odběr aspirátu kostní dřeně, pokud je proveden správně na správném místě, nepřináší v podstatě žádné komplikace. Autor se nikdy nesetkal s iatrogenní infekcí po punkci. Taktéž často obávané krvácení po aspiraci kostní dřeně u pacientů s koagulopatií (včetně pacientů s téměř absencí trombocytů) autor nikdy nepozoroval.

Systematický přístup k posuzování aspirátu kostní dřeně

Posouzení aspirátu kostní dřeně vyžaduje poměrně značné teoretické znalosti morfologie prekursorů krevních buněk a ještě větší praktické zkušenosti. Podle mínění autora není možné se naučit posuzovat vzorky kostní dřeně pouze z knih. Na základě osobních zkušeností doporučuji posuzovat prvních několik desítek preparátů vždy se zkušeným cytologem.

1. Ještě před posuzováním jaderných buněk se zhodnotí obecná kvalita preparátu, míra obarvení a míra kontaminace krví.
2. Celularita preparátu – určuje se podle proporcionálního zastoupení tukových vakuol v zrnkách kostní dřeně. Zrnka jsou velké (na sklíčku prostým okem viditelné) shluky prekursorových buněk a buněk stromatu kostní dřeně.
3. Množství megakaryocytů – určuje se pod malým zvětšením (100x) nejlépe v celém jednom preparátu.
4. Posouzení erytroidní řady – morfologie erytroidních prekursorů, a přítomnost případných aberantních buněk (dyserytropoeza). Dále se posuzuje maturace – dozrávání erytroidních buněk. Počty mladých a zralejších prekursorů erytrocytů by měly být v určitém poměru.
5. Posouzení myeloidní řady – morfologie a posouzení maturace – poměr mladých a zralejších.
6. Stanovení M/E poměru (= poměr všech myeloidních ku všem prekursorům erytroidní řady). Norma se pohybuje mezi 0,75/1 až k 2/1.
7. Přítomnost dalších buněk – lymfocytů a lymfoblastů (obrázek 6), plazmocytů, makrofágů, histiocytů, mastocytů a nádorových buněk (metastazujících). Dále při podezření se hledají parazité, zejména leishmanie.
8. Stanovení cytologické diagnózy.
9. Klinická interpretace nálezů – případně doporučení další diagnostiky či terapie.

Autor

MVDr. David Hanzlíček, DVM
Klinika JAGGY, s.r.o.
Komárovská 5
61700 Brno
e-mail: hanzlicek@jaggy.cz

• 

• 

• 

• 

• 

• 

•